Olivier Henry, Program Manager Life Sciences and Medical Device Technologies bij imec, legt uit wat de belangrijkste uitdagingen zijn in bioprocess-monitoring en hoe chiptechnologie kan bijdragen tot het realiseren van industrie 4.0 in bioprocessing.
De belangrijkste uitdagingen bij bioproces-monitoring
Zowel in het upstream als het downstream gedeelte van een bioproces moet veel worden geanalyseerd. Dit om ervoor te zorgen dat de groeiomstandigheden perfect zijn afgestemd op de behoeften van de cel (upstream), dat er geen contaminanten in het eindproduct zitten en dat het product veilig in gebruik is en voldoet aan alle voorschriften (downstream).
Schema van een typische bio-procesflow.
Olivier Henry: "Vandaag de dag worden veel tests (bijvoorbeeld om de veiligheid en steriliteit te garanderen) uitgevoerd door handmatig een monster uit de processtroom te nemen. Dit vereist goed opgeleid personeel en het vormt een risico voor de goed gecontroleerde omgeving waarin het bioproces moet plaatsvinden. Vooral voor aseptische bioprocessen (bv. de productie van vaccins) is dit een probleem.
Sommige stalen kunnen niet ter plaatse geanalyseerd worden en moeten naar een gespecialiseerd labo vervoerd worden omdat er specifieke apparatuur of expertise nodig is. Indien (een deel van) virussen of bacteriën opgespoord en geïdentificeerd moeten worden, duren deze tests enkele dagen. Dit ‘tijdverlies’ zorgt ervoor dat de producten niet in real time kunnen worden vrijgegeven".
Vandaag de dag richt PAT (Process Analytical Technologies) zich voornamelijk op offline testen: monsters worden uit de procesflow genomen en ter plaatse of in een gespecialiseerd labo op locatie geanalyseerd. Dit is niet ideaal vanwege logistiek en tijdsdruk. Chiptechnologie is nu matuur genoeg om de focus van PAT te verleggen naar online en inline testen.
Niet alleen vanwege de procesflow is er een tijdsdruk. Denk bv. aan celtherapie: de patiënt heeft zijn gepersonaliseerde medicatie zeer dringend nodig. Tijd verliezen met logistiek en testen in off-site labo's is niet gewenst voor dit soort producten.
Olivier Henry: "Een ander probleem met de huidige PAT en sensoren voor bioproces-monitoring is contaminatie van het sensoroppervlak: wanneer cellen of andere componenten zich aan het oppervlak van de sensor hechten, wordt het gepassiveerd en verliest het zijn gevoeligheid. Daarom is een frequente kalibratie nodig.
En tot slot vereist de gebruikte PAT nogal dure apparatuur, zodat niet elke bioreactor goed kan worden uitgerust of niet elke processtap goed kan worden bewaakt".
Industrie 4.0 in bioprocessing dankzij chiptechnologie?
De halfgeleidertechnologie en haar producten - elektronische en fotonische chips - hebben een revolutie teweeggebracht in onze manier van werken en leven. Neem bijvoorbeeld de smartphone die ontzettend veel functies bevat in zo'n klein apparaat.
Hetzelfde is mogelijk voor bioproces-monitoring: halfgeleidertechnologie maakt het mogelijk om lab-functionaliteiten te miniaturiseren tot kleine lab-op-chips die zelfs geïntegreerd kunnen worden in de bioreactoren of de procesflow. Voorbeelden zijn: mini-versies van PCR-reactoren, scheidingsmodules, celsorteerders, spectroscopen en microscopen, .... en dit alles tegen een lage kostprijs omdat de halfgeleidertechnologie zich richt op massaproductie en parallellisatie.
Olivier Henry: "Bovendien maakt halfgeleidertechnologie gebruik van een sterk gecontroleerd productieproces met als resultaat chips met zeer precieze specificaties en reproduceerbare prestaties. Ook laat halfgeleidertechnologie toe om verschillende soorten sensoren (bv. optisch, akoestisch, elektrisch) te integreren op één enkele chip met een heel klein oppervlak, arrays van sensoren te creëren voor multiplexmetingen, microfluïdica te integreren voor het aanbrengen van de stalen, en opent het nieuwe mogelijkheden voor sensorkalibratie en continue monitoring.”
Een bouwdoos van chips
Hoe kunnen chips bijdragen tot een real-time, kalibratievrije, snelle, op afstand bediende en inline bioproces-monitoring? Olivier Henry: "De onderstaande voorbeelden tonen de mogelijkheden van chips aan voor een veelheid van toepassingen in de biowetenschappen, waarbij fysische, chemische en biochemische parameters worden gemeten. Door deze technologieën verder te ontwikkelen en specifiek te tunen voor een bepaalde toepassing, is het een kleine stap om PAT voor bioprocessing verder te optimaliseren.
Een geminiaturiseerde multi-ionsensor
Imec-onderzoekers ontwikkelden multi-ionsensoren voor vloeistofmonitoring. Ze gebruiken dezelfde technologie - iongevoelige elektroden - als de huidige grote en dure één-parameter sensoren, maar op basis van chiptechnologie kan het systeem veel kleiner gemaakt worden. Zo klein zelfs dat een hele reeks elektroden op een oppervlakte van ongeveer 1 cm² kan worden geplaatst. Olivier Henry: "Naast het meten van specifieke ionen (Cl-, Na+, K+, Ca2+, en NO3-), kan de sensor ook de pH, opgeloste zuurstof en zoutconcentratie van een oplossing meten. Het is een generiek platform dat op maat gemaakt kan worden voor specifieke toepassingen: door de selectieve membranen op de elektroden te vervangen, kan de sensor worden gebruikt om andere ionen te detecteren. Het is ook relatief eenvoudig om bijvoorbeeld een temperatuursensor op dezelfde chip te integreren.
Eigenschappen van imecs multi-ionsensor en enkele voorbeelden van de parameters die kunnen gemeten worden.
Een essentieel onderdeel van de multi-ionsensor is de referentie-elektrode, die zich eveneens op de kleine chipoppervlakte bevindt. De verpakte sensor is bovendien voorzien van uitleeselektronica en een radiocomponent voor het draadloos doorsturen van de gegevens. Het is dus in feite een soort miniatuurdoosje met bouwstenen waar je de componenten aan kunt toevoegen die je nodig hebt. En omdat het systeem gebaseerd is op chiptechnologie, is het allemaal zeer compact en goedkoop.".
Geintegreerde chip met pH, ionsensoren en microfluïdica. Het is mogelijk om deze ‘vloeistofsensor’ in twee versies te voorzien: een op silicium en een op een dun plooibaar substraat.
Dit soort geminiaturiseerde vloeistofsensor kan gebruikt worden in de upstream procesflow voor de productie van yoghurt, bier, wijn en celtherapieproducten. Door het feit dat de technologie relatief goedkoop is, komt het ook binnen handbereik van bv. kleine brouwerijen. Het kan ook zeker een verschil maken voor celtherapie, omdat je daar een materiaal gebruikt dat sterk varieert - de cellen van een specifieke patiënt - dat heel anders kan reageren op dezelfde kweekomstandigheden.
Een mini-Raman spectroscoop
Raman spectroscopie wordt gebruikt om materialen - vloeistoffen, poeders, vaste stoffen - te identificeren en om meer te leren over de samenstelling van de materialen. Door laserlicht op het materiaal te schijnen en een specifiek deel van het verstrooide licht te analyseren, kan een spectrale grafiek worden gemaakt. Hierin kan men de spectrale 'vingerafdruk' van elk materiaal en elke verbinding herkennen.
Een bekende spectrometer is gebaseerd op de Michelson interferometer. Het nadeel van dit ontwerp - vooral als je het wilt miniaturiseren - is dat er twee spiegels worden gebruikt, waarvan er één beweegt.
Imec-onderzoekers ontwikkelen een geïntegreerde fotonica-versie van zo'n schema, zonder bewegende delen: de geïntegreerde ruimtelijk heterodyne spectrometer, een gepatenteerde oplossing voor een miniatuur Raman-spectroscoop.
Imecs Raman-op-chip, gebruikmakend van een miljoen interferometers bovenop een CMOS-beeldsensor. Deze opbouw maakt extreme miniaturisatie mogelijk en door gebruik te maken van chiptechnologie kan de prijs van het apparaat veel lager zijn dan die van de huidige apparaten.
Olivier Henry: "Raman-spectroscopie is nuttig in zowel het upstream als het downstream bioproces, om de samenstelling van de vloeistoffen te controleren. Bijvoorbeeld om te beslissen of de samenstelling van het voedingsmedium voor cellen optimaal is. Zo kan het interessant zijn om de consumptie van analyten (bv. glucose) of de productie van metabolieten (bv. lactaat) op te volgen en mogelijk zelfs feedback-gecontroleerde bioproces-optimalisatie toe te passen.”
Een lensvrije microscoop
Voor sommige processtappen (bv. in celtherapie-bioprocessing) is het belangrijk om de morfologie van de cellen visueel te inspecteren om directe feedback te krijgen over de levensvatbaarheid en algemene conditie van de cellen. Normaal gesproken wordt dit uitgevoerd door een procesoperator die een staal neemt uit de bioreactor en de cellen inspecteert onder een microscoop. Deze handmatige observatie heeft belangrijke beperkingen, bijvoorbeeld het feit dat bepaalde eigenschappen bijna onmogelijk handmatig correct te kwantificeren zijn en dat er een variabiliteit bestaat tussen verschillende operatoren.
Olivier Henry: "Imec heeft een lensvrije beeldvormings-cytometertechnologie ontwikkeld die geïntegreerd kan worden met bioreactoren en een oplossing kan bieden voor in-flow cell imaging. Het lensvrije systeem maakt gebruik van een coherente lichtbron (bv. LED of LASER) en een CMOS-beeldcamera om het licht op te vangen dat van kleine objecten wordt afgebogen. Het opgevangen diffractiepatroon (een hologram genoemd) lijkt op het rimpeleffectpatroon dat wordt veroorzaakt door een object dat op een wateroppervlak landt. Aangepaste softwarealgoritmen zijn nodig om het hologram te reconstrueren tot een in-focus beeld dat lijkt op het object dat wordt afgebeeld. Het is een compacte oplossing, die een groot gezichtsveld en een zeer goede resolutie mogelijk maakt, tegen een betaalbare prijs. Er wordt ook een op machine learning-gebaseerde beeldanalyse en classificatie flow ontwikkeld om de beelden te evalueren en onderscheid te maken tussen specifieke celtypes met behulp van krachtige classificatiealgoritmen.
Imecs lensvrije beeldvormingstechnologie maakt directe cel-inspectie en -classificatie mogelijk, hetzij in een statische cultuur, maar ook met een voldoende hoge beeldsnelheid om in-flow te werken. Om de mogelijkheden ervan aan te tonen, werd een gemengd monster van witte bloedcellen onderzocht. De lensvrije beeldvormingstechnologie was in staat om drie celtypes in het monster te onderscheiden: lymfocyten, granulocyten en monocyten.
Een prototype van een lensvrije in-line holografische microscoop voor statische culturen.
De lensvrije beeldvormingstechniek werd al gebruikt in een conventionele incubator voor celcultuur zoals typisch gebruikt in laboratoria, en dit voor het monitoren en evalueren van in-vitro cardiale contractiliteit. Het voordeel in dit geval was een 50x groter gezichtsveld met 50x goedkopere apparatuur. Een andere set-up, gebaseerd op hetzelfde principe, werd ontwikkeld voor eencellige migratie-tests om het migratiepotentieel van metastatische en niet-metastatische adenocarcinoom borstcellen te vergelijken. Ook in dit geval werd de compacte opstelling geïntegreerd in een standaard celcultuur-incubator.
Tot slot werd de lensvrije microscoop geïntegreerd in een lab-op-chip apparaat dat werd ontwikkeld om cellen te sorteren. Tientallen tot honderden van deze cel-sorteerapparaten - slechts 1 mm² groot - kunnen gecombineerd worden op een chip om een hoogwaardige celsortering mogelijk te maken.
Imecs cell sorter technologie die gebruik maakt van lensvrije microscopie.
Een proteïne-detectie chip
Door het analyseren van bijproducten van het celmetabolisme - eiwitten en enzymen - die worden opgenomen uit of afgescheiden in het groeimedium, kan de biologische toestand van de cellen worden bepaald. Huidige technologieën, bv. gebaseerd op immunoassays, massaspectrometrie, chromatografie of spectroscopie, zijn niet altijd beschikbaar in online-opstellingen, vereisen een complexe staalvoorbereiding en hebben vaak een gebrek aan specificiteit in complexe groeimedia met een hoge eiwitachtergrond.
De mainstream benadering voor eiwitdetectie is het gebruik van immunoassays, meestal ELISA in één van de vele varianten. Het is een label-gebaseerde benadering waarbij het label verantwoordelijk is voor signaalverhoging en de onderdrukking van achtergrondsignalen en dus voor de goede gevoeligheid en specificiteit van ELISA's. Een nadeel is dat ongebonden labels moeten worden weggespoeld voordat de meting kan worden uitgevoerd, hetgeen de workflow bemoeilijkt en de resultatentijd vergroot. Als alternatief zijn veel labelvrije technieken onderzocht, maar deze hebben steevast te lijden onder een slechte specificiteit en hebben daarom slechte detectielimieten in complexe matrices.
Olivier Henry: "Als alternatief ontwikkelt imec fotonische immunoassays. Fotonica is een bekende technologie die gebruikt wordt in bijvoorbeeld glasvezels om gegevens op een efficiëntere manier te transporteren. Maar fotonische golfgeleiders en andere componenten kunnen ook gebruikt worden voor life science toepassingen. Om dit mogelijk te maken heeft imec - samen met partners in het Europese PIX4life-project10 - een siliciumnitride fotonica pilootlijn opgezet. Een volledige bibliotheek van fotonische componenten is beschikbaar voor life science bedrijven om de volgende generatie fotonische biochips te bouwen. Met dit fotonicaplatform - en meer specifiek met het gebruik van fotonische golfgeleiders - heeft imec een fluorescentie-gebaseerd immunoassay ontwikkeld dat gebruikt kan worden om relevante eiwitten in bioprocessing te monitoren.
De specificiteit, gevoeligheid en detectiegrenzen zijn vergelijkbaar met ELISA, maar het maakt een snelle kinetische, wasvrije uitlezing mogelijk. Het belangrijkste element van deze immunoassay is een fotonische chip die gemakkelijk geïntegreerd kan worden in een bioreactor. Merk op dat deze techniek generiek is en dat elk eiwit van belang kan worden gedetecteerd met deze immunoassay.”
Een DNA amplificatie & detectie chip
PCR of polymerasekettingreactie is een bekende techniek om DNA- of RNA-detectie in stalen te doen. Olivier Henry: "Stel je voor dat alle laboratoriumfunctionaliteiten die nodig zijn voor PCR, worden geminiaturiseerd en op een chip worden geplaatst. In het geval van bioprocessing kan dit interessant zijn om te testen op verontreinigingen zoals bacteriën of virussen, op een compacte, geautomatiseerde en snelle manier, zeer geschikt voor een PAT.”
Imec ontwikkelde een kleine siliciumchip die monstervoorbereiding, DNA-extractie en kwantificering kan uitvoeren en kleine reactiekamers heeft om binnen enkele minuten een volledige PCR-reactie uit te voeren. De chip bevat een geëtste 1,3 µL kronkelende microreactor, geïntegreerde aluminium heaters, thermische isolatie-sleuven en microfluïdische kanalen. De chip werd reeds gebruikt voor de snelle en gevoelige detectie van virussen en bacteriën in klinische monsters.
Een chip (1 op 2cm) op basis van silicium voor staalvoorbereiding, DNA-extractie en kwantificering, met qPCR-reactie-microkamers. Elke reactiekamer is ingesloten door isolerende sleuven.
Conclusie
Olivier Henry: "Wij zijn ervan overtuigd dat chiptechnologie een revolutie kan teweegbrengen in bioproces-monitoring en realtime inline en online monitoring mogelijk kan maken. In dit artikel lieten we vijf verschillende technologieplatformen zien - de multi-ion-sensor, de Raman-spectroscoop, de lensvrije microscoop, de proteïne-detectiechip en de DNA-amplificatie&detectie-chip - die in verschillende stadia van het bioproces kunnen worden gebruikt. Hoewel deze technologieën nog niet zijn afgestemd op de specifieke behoeften van bioprocesmonitoring - we hebben alleen voorbeelden laten zien van projecten op het gebied van life sciences - is het mogelijk om elk van de technologieën in te zetten als PAT voor inline en online monitoring. Samen met bedrijven die actief zijn op het gebied van bioprocessing, willen we oplossingen op maat verder ontwikkelen en het concept van industrie 4.0 op het gebied van bioprocessing helpen implementeren.”
Meer weten?
Ben je geïnteresseerd om met imec samen te werken aan één van deze technologieën voor bioprocesmonitoring, laat het ons dan weten.
